De nieuwe massaspectrometer

Wat is het?

Een massaspectrometer meet uiterst nauwkeurig de massa van moleculen in een oplossing. Recent is de nieuwe Orbitrap Fusion Tribrid LC massaspectrometer in bedrijf voor Sanquin Research.

Wat kun je ermee?

We gebruiken het apparaat om te bepalen welke eiwitten aanwezig zijn in een eiwitcomplex, een organel of in specifieke cellen. We kunnen ook meten of de eiwitten gemodificeerd zijn met bijvoorbeeld een fosfaatgroep of een suikergroep. Daarnaast wordt het apparaat gebruikt om de interactie tussen eiwitten te bestuderen.

Wat is het resultaat, wat komt er uit?

Ter voorbereiding wordt een eiwitmengsel behandeld met een enzym dat na een specifiek aminozuur knipt. Hiervoor wordt vaak Trypsine gebruikt, dat peptidebindingen splitst waarvan de carboxylgroep afkomstig is van een van de basische aminozuren lysine en arginine. Via een chromatografiekolom komen de peptiden met een bepaalde lading in de massaspectrometer terecht. Deze meet zeer nauwkeurig de massa/lading ratio. De peptide-ionen worden vervolgens gefragmenteerd en weer op massa/lading gedetecteerd. Omdat de theoretische massa van ieder mogelijk peptide en de fragmenten daarvan bekend is, kan met behulp van de computer de identiteit van het peptide worden vastgesteld. De computer houdt daarbij rekening met modificaties zoals een fosfaatgroep, of een suikergroep. De geïdentificeerde peptiden geven aan welke eiwitten het eiwitmengsel bevat, hoeveel er van ieder eiwit relatief aanwezig is, en waar de eiwitten gemodificeerd zijn.

Meer weten? Dit review geeft een goede samenvatting:
Walther TC, Mann M. Mass spectrometry-based proteomics in cell biology. J Cell Biol 2010; 190(4):491-500. 

Wat is de innovatie?

Massaspectrometrie is niet nieuw, maar heeft een grote vlucht genomen nu het genoom van zoveel organismen bepaald is. Aan de hand van het genoom kan de massa van peptiden exact voorspeld worden, en kunnen we zonder aannamen vooraf onderzoeken welke eiwitten voorkomen in een cel.
De techniek van de massaspectrometer is de laatste jaren sterk verbeterd. De toegenomen gevoeligheid maakt het mogelijk zeer complexe mengsels te analyseren zoals ungefractioneerd cellysaat. Maar er zijn ook nieuwe technieken ontwikkeld voor het onderling vergelijken van complexe mengsels, en de identificatie van bijvoorbeeld gefosforyleerde of geglycosyleerde eiwitten. Sommige researchgroepen gebruiken de zogenaamde SILAC methode om met grote gevoeligheid eiwitmengsels te vergelijken afkomstig uit verschillende cellen. De cellen worden daarvoor opgegroeid in medium dat een lichte of zware vorm van een bepaald aminozuur bevat (zie ook www.silac.org). Door de cellysaten één op één te mengen kan de hoeveelheid van een licht en zwaar peptide meteen worden vergeleken. De massaspectrometer kan ook gebruikt worden om de interactie van eiwitten te bestuderen zoals het voorbeeld in figuur 1 aantoont.    

AFBEELDING TOEVOEGEN

Hoe deden we het vroeger?

Vroeger werd een onbekend eiwit eerst opgezuiverd, en daarna kon de aminozuurvolgorde worden bepaald. Daarvoor was heel veel materiaal nodig, het kostte veel tijd, en er werden geen onverwachte eiwitten gevonden.

Wie werken er mee?

De techniek is bij Sanquin Research geïntegreerd in de afdeling Plasma Eiwitten. Sander Meijer is hoofd van het Proteomicslaboratorium binnen deze afdeling. Hij initieert en stimuleert het gebruik van het nieuwste type massaspectrometer dat onlangs bij Sanquin is geïnstalleerd. Hij wordt daarbij terzijde gestaan door Carmen van der Zwaan die andere wetenschappers wegwijs maakt in het gebruik. Maartje van den Biggelaar ontwikkelt het meten van gefosforyleerde eiwitten1. De groep van Jan Voorberg heeft onlangs geanalyseerd welke peptiden van het stollingseiwit Factor VIII aan MHC moleculen gebonden zijn op antigeen presenterende cellen2. De massaspectrometer zal worden gebruikt door meerdere promovendi en postdocs binnen de afdeling Plasma Eiwitten. Ook in andere onderzoeksgroepen maken al veel wetenschappers gebruik van massaspectrometrie.

Wat betekent het voor de medische wereld?

De krachtige nieuwe massaspectrometer die nu geïnstalleerd is maakt het mogelijk zeer complexe mengsels van peptiden te analyseren. Daarmee kunnen we in bloedcellen van patiënten kijken of er eiwitten ontbreken, en welke dat dan zijn. We kunnen ook onderzoeken of de eiwitmodificaties anders zijn. Modificaties kunnen globaal anders zijn omdat er een enzym of een signaalmolecuul ontbreekt, of de massa van een specifiek eiwit verandert omdat er een mutatie in een eiwit aanwezig is. Daarnaast kan de analyse van eiwitten in het plasma van patiënten van belang zijn voor verder onderzoek en uiteindelijk voor het stellen van een diagnose. De massaspectrometer wordt ook gebruikt voor ‘trouble shooting’ en kwaliteitscontrole bij productie.
Voorlopig zullen onderzoekers bij Sanquin de gebruikers zijn, met het doel om tests te ontwikkelen voor snelle identificatie en behandeling van afwijkingen in bloedcel vorming en –functie.

Publicaties

1. Van den Biggelaar M et al. Quantitative phosphoproteomics unveils temporal dynamics of thrombin signaling in human endothelial cells. Blood 2014, in press
2. Van Haren SD et al. Limited promiscuity of HLA-DRB1 presented peptides derived of blood coagulation factor VIII. PLoS One 2013; 8(11):e80239.