De nieuwe multifoton microscoop

Wat is het?

Een multifoton microscoop (ook bekend als twee-foton microscoop) maakt het mogelijk om de samenstelling van weefsels driedimensionaal te bestuderen. Recent is de nieuwe Leica SP8 met een Spectraphysics DeepSee Insight laser in bedrijf bij Sanquin Research. Behalve de positie van eiwitten in gefixeerde preparaten, kunnen ook actieve processen worden bestudeerd in levende organismen zoals de muis. Een voorbeeld is de aanhechting van witte bloedcellen aan de bloedvaten.

Wat kun je ermee?

Door gebruik te maken van een gepulste infrarood laser kunnen dikkere stukken weefsel worden onderzocht. Door specifieke eiwitten in het weefsel met fluorescente probes te labellen, kan de expressie van deze eiwitten in de verschillende onderdelen van het weefsel bekeken worden. De infrarood energie dringt dieper door in het weefsel. Daar waar de energie van twee fotonen samenkomt is de gezamelijke energie voldoende om een fluorochroom te activeren. De fotonen zijn afkomstig uit twee elkaar kruisende lasers. Dit maakt het mogelijk om een stuk weefsel te scannen, en een driedimensionale reconstructie te maken van het weefsel. Het doordringend vermogen van de infrarood energie in weefsels, maakt het ook mogelijk om met deze microscoop actieve processen te bestuderen, zoals contact tussen cellen in het onderzochte weefsel.

Wat is het resultaat, wat komt er uit?

Weefsels kunnen worden ingebed in agarose om ze te immobiliseren. Het weefsel wordt vervolgens onder de microscoop gelegd, waarna het tot een diepte van enkele honderden micrometers kan worden gescand. Bepaalde structuren, zoals collageen, kunnen zonder specifieke aankleuring worden aangetoond door gebruik te maken van verschillende golflengtes. Na afloop van een scan, kan met behulp van speciale software een 3D reconstructie worden gemaakt van het weefsel. Het is ook mogelijk om een onder narcose gebrachte muis onderzoeken, waarvan het weefsel van interesse zorgvuldig is geprepareerd. Vervolgens kunnen o.a. de interacties van cellen en de distributie van eiwitten en cellen in de tijd worden gevolgd. Een voorbeeld hiervan is weergegeven in figuur 1.
Meer weten? Dit review geeft een goede samenvatting: 
Helmchen F, Denk W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods 2005; (12):932-40.

AFBEELDING NOG INVOEGEN

Deze afbeelding toont een reconstructie van een klein deel van het dijbeen van de muis. In blauw is het bot zichtbaar; de groene bolletjes zijn de kernen van de cellen langs het bot, en van de bij elkaar geclusterde beenmergcellen in het dijbeen. Door het beeld te laten draaien krijgen we een 3D weergave van de bloedvormende cellen in dit bot.

Wat is de innovatie?

Multifoton microscopie heeft de laatste 10 jaar een sterke ontwikkeling doorgemaakt. Het gebruik van multifoton microscopie maakt het mogelijk om resultaten die verkregen zijn met behulp van in vitro gekweekte cellen, en andere technieken, in het perspectief van een weefsel te plaatsen. De distributie van een eiwit in het weefsel, of de interactie van verschillende cellen binnen het weefsel kan worden bestudeerd zonder het weefsel te verstoren. Multifoton microscopie is een breed toegepaste techniek die wordt toegepast in de immunologie, oncologie, neurowetenschappen en cardiovasculaire aandoeningen. De techniek heeft de afgelopen jaren bijvoorbeeld onze kennis vergroot van cel interacties bij ontstekingsprocessen. Bij Sanquin is multifoton microscopie een uitermate geschikte techniek om meer translationeel onderzoek mogelijk te maken.
De multifoton microscoop die nu bij Sanquin geinstalleerd is maakt gebruik van een nieuw type detectoren met een hoge sensititiveit. Bovendien maakt het gebruik van de nieuwste lasersystemen, waardoor er met hoge infrarode golflengtes kan worden gewerkt, en meer fluorescente probes kunnen worden gebruikt. Tot slot kunnen met behulp van de resonant scanner tot 8000 beeldlijnen per seconde gescand worden, waardoor het mogelijk is om dynamische processen te bestuderen.

Hoe deden we het vroeger?

Traditioneel werden weefsel bestudeerd door hier coupes van te maken en met behulp van confocaal microscopie te bekijken. Voor deze technieken is echter vaak fixatie van weefsel nodig en is het niet mogelijk om in vivo imaging te doen.

Wie werken er mee?

De techniek is bij Sanquin Research geïntegreerd in de afdeling Moleculaire Celbiologie. Timo Rademakers is recent als postdoc begonnen binnen deze groep, en zal het gebruik van de multifoton microscopie binnen Sanquin implementeren. Hij heeft gedurende zijn promotie-onderzoek gebruik gemaakt van functionele in vivo multifoton imaging in atherosclerose. Met zijn ervaring zal multifoton microscopie verder werden opgezet en ontwikkeld binnen Sanquin. Hij wordt daarbij terzijde gestaan door Erik Mul en Mark Hoogenboezem van de centrale faciliteit. Samen zullen ze andere wetenschappers op weg helpen met multifoton imaging. De multifoton microscoop zal worden gebruikt door meerdere promovendi en postdocs binnen de afdeling MCB. Ook in andere onderzoeksgroepen is er al veel interesse voor de multifoton microscoop. Voorlopig zal de microscoop vooral voor onderzoek worden gebruikt.

Wat betekent het voor de medische wereld?

Binnen Sanquin zal de techniek gebruikt worden voor wetenschappelijk onderzoek, en dat onderzoek is van groot medisch belang. Vooral onderzoek naar de migratie van bloedcellen door de vaatwand, en onderzoek naar de interactie van cellen in het beenmerg zal op termijn van belang zijn voor celtherapie: bijvoorbeeld het verbeteren van transfusie efficiëntie, stamceltherapie, en de behandeling van kankerpatiënten met immuuncellen.